狗狗细小是什么意思啊？
细小又称“犬细小病毒病”，是犬的一种具有高度传染性的急性消化道传染病性病毒性肠炎。其临床特点为犬出血性小肠粘膜炎、腹泻、呕吐伴脱水及酸中毒，发病率高，死亡率极高；该病的病原体为细小病毒科、细小病毒属的犬细小病毒(canine parvovirus，CPV)。 1978年Koprowskietal首先从患犬细小病毒的狗粪便中分离到CPV-2a型毒株。1983年英国和美国相继发生了由CPV引起的犬发病和死亡事件，之后世界各地均有发生[4]。我国于1986年在广东首次报道本病，此后迅速蔓延至全国各地，成为危害犬群的主要烈性传染病之一[5]。 目前，临床上常将犬细小病毒病与冠状病毒病（coronavirus disease in dogs， CD）一起作为严重威胁犬健康的两种传染性疾病进行诊断和治疗研究。尽管这两种传染病在病理学特征上存在差异，但在临床症状、流行病学特点等方面十分类似，因而常被混淆在一起[6]。目前临床上对CD的诊断相对容易，但对于CPV的诊断仍缺乏有效的临床诊断手段。由于CD与CPV常同时感染同一犬只而导致混合感染的发生，而混合感染的临床症状往往更加严重并缩短犬类的存活时间，因此两者常常被混为一谈[]。虽然临床上常采用ELISA等方法检测患病犬只血清中的抗体来进行鉴别诊断，但由于CPV抗原易产生交叉免疫反应而影响检测结果的准确性[8]。所以，有必要建立一种能够区分二者且适用于临床诊断的分子生物学方法，以利于对这二者的区别对待以及更有效地控制疾病的传播。
一、引言 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种体外特异性扩增目的DNA片段的核酸技术.它可在短时间内大量复制靶序列，因而被广泛应用于病原微生物的诊断[10]。近年来，随着PCR技术的不断完善和发展，PCR已发展成为检测微量核酸的高效手段;同时由于荧光定量PCR(荧光定量PCR)灵敏度高、特异性强等优势使其应用范围进一步得到扩展[11-12]。
二、实验材料、试剂与方法 ⑴仪器与设备：DYY-7C电泳仪(北京六一仪器厂);TDL-5高速台式离心机 (上海安亭科学仪器制造公司);BSZ-1全自动微生物量分析系统 (湖南湘仪实验室仪器开发有限责任公司);PTC-110恒温水浴锅 (美国BioRad公司);MX-3000P PCR仪 (Stratech Scientific Ltd，中国广州);ABI PRISM 7300 SBT Sequence Detection System荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)。
⑵主要试剂：DL2000 DNA ladder marker、dNTP、Taq polymerase均购于TaKaRa公司 ;RNAiso Plus试剂盒购于Takara Bio Inc．;反转录试剂盒购自Invitrogen公司，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列见表1，表2。
⑶实验动物：健康成年犬一只，体重10kg左右，购于江苏无锡某宠物店。 ⑷样品采集：取新鲜粪便约1g，置于带盖离心管中，加入5ml RNALsoPlus缓冲液，旋涡振荡，充分溶解粪便后转入2ml EPS管中，置冰上30min，4℃下12000r/min离心10min取上清，-70℃保存待测。
⑸RNA提取：按照RNAiso Plus试剂盒操作说明提取粪便中提取物的总RNA，经1%的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，并用分光光度计测定浓度。 RNA纯度测定：用紫外分光光度法测定所提RNA样品的OD值，根据OD260和OD280的比例计算RNA样品的含量。 核酸纯度测定：配制含200μg/L RNase A的溶液，加入2μl样品，37℃孵育30min使RNA降解。然后向上述混匀的样品中加入等体积的苯酚氯仿抽提一次，再加入0.5倍体积的异丙醇沉淀DNA，12000r/min离心5min，去上清。加无水乙醇洗涤沉淀两次后，加入50~100μl TE溶解沉淀。
⑹cDNA第一链合成：取5μl总RNA，加入Oligo dT1st-mix1μl，ddH2O补足至12 μl，42℃孵育2h，70℃孵育15 min以灭活逆转录酶，一20℃保存待用。 ⑺模板DNA制备：取2 μl cDNA，加入3μl H2O，3 μl EDTA、100 mM 氢氧化钠各1 μl，混匀后用酚-氯仿抽提2次，再用醋酸钠和乙醚洗涤一次，将DNA沉淀溶于30ul H2O中，一20℃保存待用。
三、实验结果 在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，结果显示，大小约为250bp的条带为阳性（图1)。
四、讨论 本研究中通过RT-PCR扩增出目的基因序列，长度约为250bp，与已知CPV基因组全序列相比有较高的同源性(87%)，与已知的CPV毒株一致，表明建立的RT-PCR方法具有良好的特异性和可靠性。本试验利用所得的引物